Moderne Methoden der Zellbiologie

IV: Fluoreszenztechniken II    (INHALT)

FLIM: Fluoreszenz-Lebenzeit-Mikroskopie

Quenching von SPQ:   Warum reagiert der Fluoreszenzfarbstoff SPQ auf eine Erhöhung der Cl--Konzentration mit einer Abnahme von Fluoreszenzintensität und Fluoreszenzlebenszeit?   Bei Absorption von Anregungslicht (hnA) werden p- Elektronen des SPQ aus dem Grundzustand (S0) in einen angeregten Zustand höherer Energie (S1 oder s2) angehoben (siehe auch Die Ursache der Fluoreszenz). Der Übergang S0 nach S1/S2 ist sehr schnell (ca. 10-15 s); die mittlere Verweilzeit der Elektronen im angeregten Zustand (die Lebenszeit) ist jedoch vergleichsweise lang: sie beträgt bei SPQ in Abwesenheit von Chlorid über 20 ns. Danach kehren die Elektronen nach S0 zurück und emittieren die bei der Anregung aufgenommene Energie in Form eines Photons (hnF).   Die SPQ-Elektronen in S1/S2 können ihre Energie aber auch auf Cl--Ionen übertragen. Bei einem Zusammenstoß des Farbstoffmoleküls mit einem Cl--Ion wird die Energie von einem SPQ-Elektron auf ein Cl--Elektron übertragen. Das dabei angeregte Cl--Elektron kehrt ohne Emission eines Photons zum Grundzustand zurück - die Energie wird in Wärme umgewandelt, es entsteht keine Fluoreszenz. Dieser Prozess wird als Kollisionsquenching (engl. to quench: löschen) bezeichnet. Die Wahrscheinlichkeit des Zusammentreffens (der Kollision) eines SPQ-Moleküls mit einem Cl--Ion steigt natürlich mit der Cl--Konzentration. Deshalb verlieren bei höheren Cl-- Konzentrationen mehr angeregte SPQ-Elektronen ihre Energie durch Quenching und tragen nicht zur Fluoreszenzintensität bei: Es kommt zur Reduktion der Fluoreszenzintensität bei Anstieg der Cl--Konzentration. Auch die Verweilzeit der SPQ-Elektronen im angeregten Zustand wird durch Quenching beeinflußt: Die Kollision mit einem Cl--Ion bietet einen zusätzlichen Weg für die Rückkehr zum Grundzustand. Dadurch erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, daß Elektronen die angeregten Zustände verlassen und man beobachtet eine Verkürzung der Lebenszeit.