Moderne Methoden der Zellbiologie

IV: Fluoreszenztechniken II    (INHALT) butmeth.jpg

FLIM: Fluoreszenz-Lebenzeit-Mikroskopie


HIGHRES (21 kbyte) Das FLIM-Prinzip
Anregung mit gepulsten Lasern
Time-correlated single-photon counting
Quenching von SPQ

Beispiel einer FLIM-Messung
 
Kulturzellen wurden mit dem Cl--sensitiven Farbstoff SPQ geladen. Durch Manipulation der Cl--Durchlässigkeit der Plasmamembran wurde Zellen mit unterschiedlichen zytoplasmatischen Cl--Konzentrationen erzeugt. SPQ wurde mit UV-Licht (360 nm) angeregt und die Fluoreszenz mit Hilfe einer Laserscanning Imaging-Apparatur registriert. Dabei wird der Laserstrahl Punkt-für-Punkt über das Sichtfeld des Mikroskops geführt und die Fluoreszenz von jedem Punkt mit einem Photonenzähler gemessen. Ein Rechner setzt dann aus den einzelnen Bilder ein digitales Bild der Zellen zusammen. So entsteht ein Bild, bei dem die Farben benutzt werden können, um Information zu kodieren
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Fluoreszenzintensität: Bei dieser Abbbildung ist die Helligkeit (die Fluoreszenzintensität) jedes einzelnen Bildpunktes dargestellt. Man kann sieben Zellen erkennen, die zum Teil sehr unterschiedliche Fluoreszenzintensität aufweisen. Aus dieser Aufnahme geht jedoch nicht hervor, ob die Unterschiede in der Helligkeit durch Unterschiede in der Farbstoffkonzentration, der Zelldicke oder der Cl--Konzentrationen verursacht werden. Fluoreszenz-Lebenszeit: Die Auswertung der Lebenszeitdaten bringt absolute Werte für die intrazelluläre Cl--Konzentration. Die Zeitkonstante t, die das exponentielle Abklingen der Fluoreszenz nach einem Lichtpuls beschreibt, wurde für jeden Bildpunkt bestimmt und farbkodiert (siehe Farbskala). Durch eine Kalibrierung mit Lösungen bekannter Cl--Konzentrationen wurde das quantitative Verhältnis von Zeitkonstante zur jeweiligen Cl--Konzentration bestimmt, so daß sich eine Farbkodierung der intrazellulären Cl--Konzentration ergibt. Man erkennt zB, daß die beiden Zellen oben links einen zehnfachen Unterschied in der Cl--Konzentration aufweisen. Trotzdem zeigen sie im Fluoreszenzintensitätsbild (linkes Bild) fast die gleiche Helligkeit.