Moderne Methoden der Zellbiologie

III: Fluoreszenztechniken I (INHALT)

Anregungsspektrum und Filter
Das Fluoreszenzmikroskop

Beobachtung von Fluoreszenz
Eine Flüssigkeit, in der eine fluoreszierende Substanz (ein Fluorochrom) gelöst ist, zeigt Fluoreszenz, wenn sie mit Licht bestrahlt wird, das geeignet ist, die Fluorochrom-Moleküle anzuregen. Fluoreszenz kann am besten in einem steilen Winkel zur Achse des Anregungslichtes beobachtet werden, weil so eine Überlagerung von Anregungs- und Fluoreszenzlicht vermieden wird. In Fluoreszenz-Photometern ist aus diesem Grund der Lichtdetektor (PMT = photomultiplier tube) rechtwinklig zum Anregungslicht angeordnet. Anregungs- und Emissionslicht können auch mit optischen Filtern getrennt werden.

Beobachtung von Fluoreszenz

Eine Flüssigkeit, in der eine fluoreszierende Substanz (ein Fluorochrom) gelöst ist, zeigt Fluoreszenz, wenn sie mit Licht bestrahlt wird, das geeignet ist, die Fluorochrom-Moleküle anzuregen. Fluoreszenz kann am besten in einem steilen Winkel zur Achse des Anregungslichtes beobachtet werden, weil so eine Überlagerung von Anregungs- und Fluoreszenzlicht vermieden wird. In Fluoreszenz-Photometern ist aus diesem Grund der Lichtdetektor (PMT = photomultiplier tube) rechtwinklig zum Anregungslicht angeordnet. Anregungs- und Emissionslicht können auch mit optischen Filtern getrennt werden.

Die Ursache der Fluoreszenz
Die Prozesse, die von der Absorption von Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht führen, werden oft mit Hilfe von Energiediagrammen dargestellt, die nach dem polnischen Physiker Alexander Jablonski benannt sind, dem Begründer der modernen Fluoreszenzspektroskopie. Ein Jablonski-Diagramm zeigt die Energien der Elektronenübergänge, die bei Absorption und Emission von Photonen auftreten. Viele Fluorochrome haben aromatische Ringstrukturen (siehe unten). Solche Moleküle besitzen delokalisierte Elektronen in sogenannten bindenden p-Orbitalen. Die Elektronen dieser Orbitale treten leicht in Wechselwirkung mit der Umgebung und erreichen bei Absorption eines Anregungsphotons in höheres Orbital (p). In bindenden Orbitalen liegen Elektronen normalerweise mit antiparallelem Spin vor - eine Anordnung, die die sogenannten Singulett-Zustände charakterisiert (S0, S1, S2). Die Absorption eines Anregungsphotons (hn_A) hebt ein Elektron aus dem Grundzustand S0 in einen der angeregten Zustände S1 oder S2. Dieser Vorgang ist extrem schnell, er vollzieht sich innerhalb etwa 10^-15 s. Aus dem oberen angeregten Zustand ist ein Übergang nach S1 möglich, ohne das eine Photon emittiert wird ("innere Umwandlung"), aber beim Übergang in den Grundzustand wird die freiwerdende Energie als Fluoreszenzphoton (hn_F) emittiert. Die Energie des emittierten Photons ist immer geringer als die des absorbierten Photons - damit ist die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts größer als die des Anregungslichts (Stokessche Regel). Die mittlere Verweilzeit im angeregten Zustand (Fluoreszenz-Lebenszeit) ist bei vielen Fluorochromen im Bereich von 10 ns. Bei manchen Verbindungen kann es zu einem Übergang aus einem angeregten Singulettzustand in einen Triplett-Zustand (T1)* kommen. Bei diesem Vorgang ("Interkombination") kommt es zu einer Spinumkehr des angeregten Elektron, und auch der Sprung in den Grundzustand erfordert eine Spinumkehr. Solche Vorgänge sind jedoch sehr unwahrscheinlich, und die Emissionsraten sind sehr gering (1-1000 pro s). Diese geringe Übergangsrate ist der Grund für das langsame Abklingen der Phosphoreszenz bei Leuchtziffern und Spielzeug, das im Dunkeln leuchtet.

Die Ursache der Fluoreszenz

Die Prozesse, die von der Absorption von Anregungslicht zur Emission von Fluoreszenzlicht führen, werden oft mit Hilfe von Energiediagrammen dargestellt, die nach dem polnischen Physiker Alexander Jablonski benannt sind, dem Begründer der modernen Fluoreszenzspektroskopie.

Ein Jablonski-Diagramm zeigt die Energien der Elektronenübergänge, die bei Absorption und Emission von Photonen auftreten. Viele Fluorochrome haben aromatische Ringstrukturen (siehe unten). Solche Moleküle besitzen delokalisierte Elektronen in sogenannten bindenden p-Orbitalen. Die Elektronen dieser Orbitale treten leicht in Wechselwirkung mit der Umgebung und erreichen bei Absorption eines Anregungsphotons in höheres Orbital (p*). In bindenden Orbitalen liegen Elektronen normalerweise mit antiparallelem Spin vor - eine Anordnung, die die sogenannten Singulett-Zustände charakterisiert (S0, S1, S2). Die Absorption eines Anregungsphotons (hn_A) hebt ein Elektron aus dem Grundzustand S0 in einen der angeregten Zustände S1 oder S2. Dieser Vorgang ist extrem schnell, er vollzieht sich innerhalb etwa 10^-15 s. Aus dem oberen angeregten Zustand ist ein Übergang nach S1 möglich, ohne das eine Photon emittiert wird ("innere Umwandlung"), aber beim Übergang in den Grundzustand wird die freiwerdende Energie als Fluoreszenzphoton (hn_F) emittiert. Die Energie des emittierten Photons ist immer geringer als die des absorbierten Photons - damit ist die Wellenlänge des Fluoreszenzlichts größer als die des Anregungslichts (Stokessche Regel). Die mittlere Verweilzeit im angeregten Zustand (Fluoreszenz-Lebenszeit) ist bei vielen Fluorochromen im Bereich von 10 ns.
Bei manchen Verbindungen kann es zu einem Übergang aus einem angeregten Singulettzustand in einen Triplett-Zustand (T1) kommen. Bei diesem Vorgang ("Interkombination") kommt es zu einer Spinumkehr des angeregten Elektron, und auch der Sprung in den Grundzustand erfordert eine Spinumkehr. Solche Vorgänge sind jedoch sehr unwahrscheinlich, und die Emissionsraten sind sehr gering (1-1000 pro s). Diese geringe Übergangsrate ist der Grund für das langsame Abklingen der Phosphoreszenz bei Leuchtziffern und Spielzeug, das im Dunkeln leuchtet.

Einge fluoreszierende Moleküle

Viele Fluorochrome haben aromatische Ringsysteme, deren delokalisierte Elektronen in bindenden p-Orbitalen für die Entstehung von Fluoreszenz wichtig sind. Chinin (quinine) war eine der ersten Substanzen, an denen Fluoreszenz untersucht worden ist (Herschel, 1845). Chinin wird durch UV-Licht angeregt und erzeugt eine schwache, bläuliche Fluoreszenz in Tonic Water, das mit Chinin versetzt ist. Fluorescein und Rhodamin spielen eine große Rolle bei der Fluoreszenz-Immunhistochemie. POPOP wird für Szintillationszähler verwendet und Acridin-Orange eignet sich als DNA-Farbstoff. Coumarin-Derivate werden in vielen Bereichen verwendet, zB für ELISA-Tests. mit Aus: Lakowicz, J.R (1999)

Einge fluoreszierende Moleküle

Viele Fluorochrome haben aromatische Ringsysteme, deren delokalisierte Elektronen in bindenden p-Orbitalen für die Entstehung von Fluoreszenz wichtig sind. Chinin (quinine) war eine der ersten Substanzen, an denen Fluoreszenz untersucht worden ist (Herschel, 1845). Chinin wird durch UV-Licht angeregt und erzeugt eine schwache, bläuliche Fluoreszenz in Tonic Water, das mit Chinin versetzt ist. Fluorescein und Rhodamin spielen eine große Rolle bei der Fluoreszenz-Immunhistochemie. POPOP wird für Szintillationszähler verwendet und Acridin-Orange eignet sich als DNA-Farbstoff. Coumarin-Derivate werden in vielen Bereichen verwendet, zB für ELISA-Tests. mit

Aus: Lakowicz, J.R (1999)