Moderne Methoden der Zellbiologie

IV: Fluoreszenztechniken II (INHALT)

Zweiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie

Das Prinzip der Zweiphotonen-Anregung

Zur Anregung muß das Fluorochrom Lichtenergie absorbieren. Das Jablonski-Diagramm rechts veranschaulicht, daß diese Energie entweder von einem einzelnen Photon oder von zwei Photonen mit halber Energie (doppelter Wellenlänge) geliefert werden kann. So kann ein Fluoreszenzfarbstoff zB mit einem Photon UV-Licht (350 nm, blau) oder mit zwei Photonen Infrarot-Licht (700 nm, rot) angeregt werden, denn

hn_{350 nm} = 2hn_{700 nm}.

Voraussetzung für die Summierung der Energie zweier Photonen ist allerdings, daß beide gleichzeitig (innerhalb von 10^-15 s) absorbiert werden. Das kann nur bei sehr hoher Lichtintensität (=Photonendichte) geschehen und ist technisch nur mit gepulsten Laserblitzen lösbar. In der Biologie werden dazu Titan-Saphir-Laser verwendet, die Femtosekunden-Pulse mit sehr hoher Energie erzeugen. Die Versuchsanordnung für Zweiphotonenmikroskopie ist unten gezeigt.

Ein Vergleich von Einphoton- und Zweiphotonen-Anregung zeigt die Vorteile der Zweiphotonen- Mikroskopie für biologische Anwendungen. In einer biologischen Probe soll ein Fluoreszenzfarbstoff angeregt werden, dess Absorptionsmaximum bei 350 nm liegt.

Links: Bei der Einphotonen-Methode wird der Strahl eines UV-Lasers auf die Probe gerichtet, und grüne Fluoreszenz entsteht im gesamten beleuchteten Bereich der Probe. Probleme können entstehen durch UV-Schäden am Gewebe und durch starke Streuung des kurzwelligen Lichtes in der Probe. Zudem entsteht Fluoreszenzlicht auch außerhalb der Brennebene des Objektivs und überlagert das Licht aus der Brennebene. Für gute räumliche Auflösung ist es notwendig, das störende Licht mit einer konfokalen Optik auszublenden.

Rechts: Bei der Zweiphotonen-Mikroskopie wird das Licht eines gepulsten Infrarotlasers durch das Objektiv fokussiert. Nur im Brennpunkt ist die Lichtintensität so hoch, daß zwei IR-Photonen gleichzeitig vom Fluoreszenzfarbstoff absorbiert werden. Deshalb entsteht nur im Brennpunkt Fluoreszenz. Die Vorteile dieser Methode liegen darin, daß IR-Licht biologische Proben weniger stark schädigt als UV-Licht, daß IR-Licht weniger stark gestreut wird, und daß kein störendes Fluoreszenzlicht außerhalb der Brennebene entsteht. Wie beim konfokalen Lasescanning-Mikroskop wird auch beim Zweiphotonen-Mikroskop der Laserstrahl durch einen Scanner über die Probe geführt.

Als Beispiel ist hier das Zweiphotonen-Mikroskop TCS MP von Leica abgebildet. Links vom Mikroskop sieht man den Titan-Saphir-Infrarotlaser (weiß) sowie einen Argon/Krypton-Laser (schwarz), der als Pumplaser für den IR-Laser verwendet wird.

Oben auf dem Mikroskop ist die Scanner-Einheit montiert. Auf dem rechten Monitor werden die aktuellen Bilder sowie dreidimensionale Rekonstruktionen von optischen Schnitten dargestellt. Der linke Monitor dient zur Bedienung des Programms.