Moderne Methoden der Zellbiologie

IV: Fluoreszenztechniken II (INHALT)

Das konfokale Laserscanning-Mikroskop

Das Prinzip der konfokalen Mikroskopie
Konfokale Fluoreszenzmikroskope
Optischer Bildaufbau mit der Nipkow-Scheibe

Zum Abrastern ("Scannen") des Objektes muß der Anregungsstrahl (grün) nacheinander auf viele Punkte des Objekts gelenkt werden. Laserlicht eignet sich für diese Anwendung besonders gut, weil ein Laserstrahl monochromatisches Licht mit hoher Intensität auf einen kleinen Punkt fokussieren kann. Um ein Bild zu bekommen, wird das Objekt Punkt für Punkt und Zeile für Zeile abgerastert. Zwei Scan-Spiegel sind dazu nötig: Einer für die Punkte innerhalb einer Zeile (X-Richtung) und einer für die Zeilen des Bildes (Y-Richtung). Das Fluoreszenzlicht (rot) wird über die selben Spiegel zum Detektor geleitet. Ein Rechner steuert über zwei Stellmotoren die Position der beiden Scan-Spiegel und rekonstruiert aus der gemessenen Fluoreszenzintensität jedes einzelnen Punktes ein Bild des Objekts.

Zudem kann der Rechner über einen weiteren Stellmotor das Objekt in Richtung des Strahlengangs (Z-Richtung) bewegen. Da die konfokale Optik dafür sorgt, daß nur Licht aus der Brennebene des Objektivs zum Detektor gelangt, können nacheinander mehrere Schichten des Objekts gescannt und abgebildet werden. Solche optische Schnitte können dann im Rechner zu drei-dimensionalen Bildern des Objekts zusammengesetzt werden.

Nach: Pawley, J.B. (1995)

Beispiel für ein konfokales Laserscanning Mikroskop: Leica TCS SP.

Das Gerät arbeitet mit einem Argon/Krypton-Laser, der sowohl blaues (488 nm als auch grünes (568 nm) Anregungslicht liefert. Das Laserlicht wird durch einen Lichtleiter zur Scan-Einheit gebracht.

In der Scan-Einheit befindet sich die Lochblenden, dichroischen Spiegel und PMTs.

Auf den Monitoren wird die Abbildung des Objekts betrachtet.

Quelle: Leica Confocal