| XI: Vom Protein zum Gen II (INHALT) |
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| Nach der erfolgreichen Reinigung eines Proteins stellt sich die Frage: Wie gelangt man von dem isolierten Protein zu der dazugehörigen Gensequenz? Eine Möglichkeit, die auch von Numa und Mitarbeitern bei der Klonierung des Na+-Kanalgens verwendet wurde, ist die Bestimmung der Aminosäuresequenz des Proteins. Ist die Aminosäuresequenz bekannt, kann auf die Nukleinsäuresequenz zurückgeschlossen werden (s. Vom Protein zum Gen III). Zunächst wird das gereinigte Protein mit Proteasen gespalten, bspw. mit Trypsin. Bei dieser enzymatischen Behandlung entstehen viele, unterschiedlich große Spaltprodukte. Bevor mit der Sequenzierung begonnen werden kann, müssen diese Peptidfragmente aufgetrennt und isoliert werden. |
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| Zur Reinigung der Peptide werden chromatografische Methoden benutzt. Insbesondere hat sich die HPLC (high pressure liquid chromatography) bewährt. Die nebenstehende Abbildung stammt aus der Originalarbeit von Noda et al. (1984) (Nature 312, 121-127) und zeigt im oberen Teil die Auftrennung aller Peptidfragmente des proteolytisch gespaltenen Na+-Kanals. Die Wechselwirkung der Fragmente mit dem Säulenmaterial wird durch Änderung der Acetonitril-Konzentration des Elutionspuffers beeinflußt. Eluatfraktionen, deren Peptidmengen ausreichend groß sind und die im Chromatogramm als deutliche "Peaks" zu erkennen sind, werden zur weiteren Reinigung erneut chromatografiert. Die Hauptprodukte werden anschließend für die Peptidsequenzierung verwendet. |
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