| Die rekombinanten Klone (bspw. Bakteriophagen) der cDNA-Bibliothek werden mit Bakterien zusammengegeben und auf Agarschalen bei 37°C vermehrt. Filterabzüge werden hergestellt und die DNA der Klone durch Alkalibehandlung freigesetzt. Die DNA bindet an das Filtermaterial und wird mit UV-Licht an dem Filter quervernetzt. Die immobilisierte DNA kann bspw. mit radioaktiv markierten Sonden (Oligonukleotidproben etc.) hybridisiert werden. Klone, die Sequenzabschnitte enthalten, die zur verwendeten Sonde komplementär sind, binden radioaktiv markierte Sondenmoleküle (= rote Punkte). Die gebundene Radioaktivität wird durch Auflegen von Röntgenfilmen sichtbar gemacht. Die erhaltenen Signale werden den rekombinanten Bakteriophagen auf der Agarschale zugeordnet. Nach mehreren Vereinzelungsschritten werden die cDNA-Abschnitte, die in den Bakteriophagen kloniert sind, sequenziert. Ergibt die Sequenzauswertung, daß die aus der klonierten cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz noch nicht der Größe des isolierten Proteins entspricht, muß nach überlappenden cDNA-Klonen gesucht werden. Dazu werden die 5'- und 3'-Endbereiche der klonierten cDNA radioaktiv markiert und die cDNA-Bibliothek erneut durchmustert. Ein weiteres wichtiges Kriterium ist, ob sich die durch Edman-Abbau ermittelten Peptid-Sequenzen in der aus der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz wiederfinden. |  |
