Moderne Methoden der Zellbiologie

III: Fluoreszenztechniken I    (INHALT)

Cell sorting /Durchflußzytometrie
Wie kann man Zellen eines bestimmten Types aus einem Gemisch unterschiedlicher Zelltypen isolieren? Solch ein Trennungsverfahren ist nützlich, wenn zB ein Protein oder die mRNA aus nur einem Zelltyp eines heterogenen Gewebes isoliert werden soll, oder wenn für die Untersuchung einer Zellart eine möglichst reine Präparation notwendig ist. Wenn einfache Trennverfahren wie Filtration oder Zentrifugation nicht geeignet sind, kann die Fluoreszenzmarkierung der Zellen genutzt werden. Dazu werden Erstantikörper benutzt, die spezifisch an Oberflächenproteine der zu untersuchenden Zellen, nicht aber an andere Zellen, binden. Nach Fluoreszenzmarkierung dieser Antikörper kann die Zellmischung mit hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Cell Sorters aufgetrennt werden.   Dieses Gerät kann Zellen identifizieren, die eine Fluorochrom tragen, und kann diese Zellen von den anderen Zellen des Gewebes trennen. Dazu wird eine Zellsuspension in einzelnen Tröpchen zerlegt, wobei Tropfengröße und Zelldichte so eingestellt werden, daß sich nicht mehr als eine Zelle in einem Tropfen befindet. Ein Ultraschall- Generator sorgt für die die richtige Tropfengröße am Ausgang einer Düse, die mehrere tausend Tropfen pro Sekunde durchläßt.   Bevor die Suspension die Düse erreicht, wird der Fluoreszenztest gemacht: Anregungslicht aus einem Laser wird in die Suspension geleitet und die Fluoreszenzemission gemessen. Wenn eine Fluorochrom-haltige Zelle das Messfenster passiert, gelangt ein Fluoreszenzsignal zu den Lichtdetektoren (Photomultiplier tubes, PMT) und das Gerät sorgt dafür, daß der Tropfen, der die fluoreszierende Zelle enthält, eine elektrische Ladung erhält (siehe unten).   Der elektrisch geladene Tropfen mit der fluoreszenzmarkierten Zelle wird dann von einem starken elektrischen Feld abgelenkt und aus der senkrechten Bahn gebracht: Zwei Ablenkplatten sorgen für diese Trennung von geladenen und ungeladenen Tröpchen. Die fluoreszenzmarkierten Zellen landen deshalb in den seitlichen Auffanggefäßen, während unmarkierte in das mittlere Gefäß fallen.   Nach: Melamed, M.R., Lindmo, T., Mendelsohn, M.L. (1990)

Elektrische Aufladung von Tropfen

Die Zellen der Suspension schwimmen in einer elektrisch leitenden Salzlösung, die durch Anlegen eines elektrischen Feldes aufgeladen werden kann. Dazu werden zwei Elektroden gebraucht: Die eine ist mit der Düse oder deren Zuführung verbunden, die andere mit einer Metallhülse, die die Düse umgibt aber nicht berührt. Wenn die Fluoreszenzmessung eine markierte Zelle registriert, aktiviert das PMT-Signal eine Spannungsquelle (V-control), die eine Spannung von etwa 100 V auf die beiden Elektroden gibt.   Diese Spannung erzeugt ein elektrostatisches Feld und dadurch eine Ladung an der Oberfläche der Flüssigkeitssäule in der Düsenzuführung. Die Ladung verbleibt auch auf den Tropfen, nachdem sie sich von der Flüssigkeitssäule gelöst haben. Das Gerät ist so konzipiert, daß die Spannung immer nur in dem Moment angelegt wird, wo sich ein Tropfen mit einer markierten Zelle (rot) aus der Düse löst, so daß nur Tropfen mit markierten Zellen elektrisch geladen werden.   Markierte Zellen reisen also in geladenen Tropfen, unmarkierte Zellen aber ungeladenen Tropfen durch das Gerät, so daß nur die ersteren im elektrischen Feld zwischen den Ablenkplatten eine Änderung der Fallrichtung erfahren.