|
Für die Expression von Fremdgenen in eukaryontischen Ammenzellen stehen verschiedene Verfahren zur Einschleusung der DNA zur Verfügung (Transfektion). Die gängigsten Methoden sind die Lipofektion und die CaPO4-Kopräzipitation. Bei der Lipofektion werden die Plasmide, in die das Fremdgen kloniert wurde, mit Liposomen gemischt. Die Liposomen werden von den Zellen aufgenommen und die Plasmid-DNA intrazellulär freigesetzt. Etwa 1 - 2 Tage nach der Transfektion kann mit der funktionellen Charakterisierung des exprimierten Proteins begonnen werden. Bei der CaPO4-Kopräzipitation werden die Zellen mit einer Mischung aus Plasmid-DNA, CaCl2 und speziellen Puffersubstanzen inkubiert. Während der Inkubation (ca. 20 Std) wird die DNA von den Zellen aufgenommen. Etwa 2 - 3 Tage nach Beginn des Experiments kann mit der Funktionsanalyse begonnen werden. Die Elektroporation ist eine weitere Möglichkeit die Fremd-DNA in die Ammenzellen einzuschleusen.
Erfolgt die Aufnahme der Fremd-DNA transient, können die exprimierten Proteine bis ca. 5 Tage nach Beginn des Experiments untersucht werden. Wenn die Fremd-DNA jedoch in das Genom der Ammenzellen integriert, können unter Verwendung spezifischer Antibiotika Zellklone erhalten werden. Diese Zellklone exprimieren das Fremdgen konstitutiv (stabil). Das Protein steht somit dauerhaft für Untersuchungen zur Verfügung.
|
|
