# Moderne Methoden der Zellbiologie

VI: Wirkstoff-Screening (INHALT) |

Bioassays | Screening mit Reportergenen Transfektion von Kulturzellen

Ein wichtiger Aspekt der Screening-Technologie ist die Entwicklung geeigneter Testmodelle, mit denen die Wirkung von Probesubstanzen auf ein Zielprotein mit Screeningverfahren untersucht werden kann. Dazu werden Zellkulturen genetisch so verändert, daß sie zum einen das Zielprotein exprimieren, zusätzlich aber so ausgerüstet sind, daß die Aktivierung des Zielproteins experimentell gemessen werden kann. Für Detektion der Aktivität des Zielproteins werden bevorzugt Fluoreszenz- und Chemiluminiszenzmethoden eingesetzt. Eine Vielfalt ionenselektiver Fluoreszenzfarbstoffe steht für solche Messungen zur Verfügung, und die Chemilumineszenz des Luciferin wird für Screening-Versuche mit Reportergenen verwendet.
Hier wird als Beispiel demonstriert, wie die Suche nach Antagonisten von a- und b- adrenergen Rezeptoren mit hilfe von Ca2+-empfindlichen Fluoreszenzfarbstofffen durchgeführt wird.

Bioassays für Antagonisten von Adrenalinrezeptoren LOWRES 50 kbyte

Um aus einer großen Menge von Testsubstanzen diejenigen herauszufinden, die als a-Antagonisten wirken, wird durch Transfektion eine Zellinie hergestellt, die a-adrenerge Rezeptoren in möglichst hoher Dichte exprimiert. Bei Aktivierung durch Adrenalin aktivieren diese Rezeptoren das Enzym Phospholipase C (PLC), das aus der Plasmamembran der Zellen den Botenstoff Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) freisetzt. IP3 öffnet Ca2+-Kanäle in der Membran des endoplasmatischen Retikulums, dem wichtigsten intrazellulären Ca2+-Speicher der Zelle, so daß Ca2+ in das Zytoplasma strömt und die zytoplasmatische Ca2+-Konzentration ansteigt. Um dieses Ca2+-Signal im Screening-Versuch zu detektieren, werden die Zellen mit einem Ca2+-emfindlichen Fluoreszenzfarbstoff geladen (z.B. fura-2, fluo-3, calcium-green). Der Farbstoff wird mit geeignetem Licht angeregt (blaue Welle) und emittiert Fluoreszenzlicht (rote Welle), das sich ändert, wenn der Farbstoff Ca2+ bindet.
Beim Screening-Versuch werden Zellen in vielen Reaktionskammern einer Multiwellplatte mit Adrenalin und mit jeweils einer Testsubstanz behandelt. Misst man bei den Zellen einer Kammer einen Ca2+-Anstieg, wirkt die Testsubstanz nicht als a-Antagonist. Bleibt das Ca2+-Signal jedoch aus, hat man einen a-Antagonisten gefunden.

b-adrenerge Rezeptoren spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation von Herzleistung und Blutdruck, und b-Antagonisten (sogenannten b-Blocker) sind deshalb von großem Interesse für die pharmazeutische Forschung. b-Rezeptoren koppeln jedoch nicht an PLC sondern aktivieren das Enzym Adenylatzyklase (AC), das aus ATP den Botenstoff cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) herstellt. Da es keine cAMP-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffe gibt, muß man sich eines Tricks bedienen und das cAMP-Signal in ein Ca2+-Signal "übersetzen". Die Zellen werden mit einem Gen transfiziert, das einen Ca2+-leitenden, cAMP-abhängigen Kanal kodiert. Bei Aktivierung der b-Rezeptoren werden diese Kanäle geöffnet, leiten Ca2+ in die Zelle und lösen so ein Fluoreszenzsignal aus. Das Ausbleiben dieses Signals weist auf die Wirkung einer Testsubstanz als b-Blocker hin.

Homepage Stephan Frings
Institut für Biologische Informationsverarbeitung im Forschungszentrum Jülich