# Moderne Methoden der Zellbiologie

VI: Wirkstoff-Screening (INHALT) |

Bioassays | Screening mit Fluoreszenzfarbstoffen Transfektion von Kulturzellen

Screening mit Reportergenen | HIGHRES 68 kbyte
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Viele Rezeptoren beeinflussen die Genexpression in der Zelle durch Aktivierung von Transkriptionsfaktoren. Wird ein Agonist für einen solchen Rezeptor im Experiment appliziert, kann die Synthese des jeweiligen Proteins (hier: Protein X) nachgewiesen werden. Beim Wirkstoff-Screening verwendet man Bioassays, die anzeigen, wenn ein Rezeptoragonist die Transkription des zu Protein X gehörenden Gens aktiviert. Dazu bedient man sich eines Reportergens, das bei Aktivierung des zu Protein X gehörenden Gens ein leicht zu messendes, optisches Signal produziert. |
Das Gen, das das Protein Luciferase kodiert, ist ein viel verwendetes Reportergen für Screening-Versuche. Luciferase kann leicht mit einem Chemilumineszenzassay nachgewiesen werden (siehe unten). Eine Methode der Verwendung von Luciferase ist rechts gezeigt: Bei den Kulturzellen, die den Rezeptor exprimieren, für den ein Agonist gefunden werden soll, wird das Gen für Protein X durch das Luciferase-Gen ersetzt. Bei Aktivierung des Rezeptors wird nach wie vor der Promotor des Protein-X-Gens aktiviert, aber der Promotor treibt nun die Transkription des Luciferase-Gens. Die Zellen können zwar nicht mehr Protein X herstellen, sie reagieren aber auf Rezeptor-Agonisten mit der Expression von Luciferase. |
Im Screening-Versuch kann nun eine große Anzahl unterschiedlicher Substanzen auf ihre Wirkung auf den Rezeptor getestet werden. Nur eine Substanz, die den Rezeptor aktiviert, wird die Expression des Reportergens Luciferase auslösen. Der Nachweis von Luciferaseexpression geschieht nach dem Ende des Experiments in Zellhomogenaten. |
Das Enzym Luciferase aus dem nordamerikanischen Leuchtkäfer Photinus pyralis katalysiert in Gegenwart von ATP und Mg2+ die oxidative Decarboxylierung von Luciferin. Dabei entstehen Lichtblitze, die sich zum Leuchten dieser Tiere aufaddieren. Zum Nachweis der Luciferaseexpression werden die Zellen lysiert, und das Zellhomogenat wird mit Luciferin und ATP gemischt. Dabei auftretende Lumineszenz zeigt die Expression von Luciferase an. |

Homepage Stephan Frings
Institut für Biologische Informationsverarbeitung im Forschungszentrum Jülich