# Moderne Methoden der Zellbiologie

IV: Fluoreszenztechniken II (INHALT) |

### Prinzip der konfokalen Mikroskopie

HIGHRES (82 kbyte) | Konfokale Fluoreszenzmikroskope Das konfokale Lasescanning-Mikroskop Optischer Bildaufbau mit der Nipkow-Scheibe

Beim konventionellen Lichtmikroskop wird das Lampenlicht durch die Kondensorlinse auf das Objekt fokussiert, und das vom Objekt ausgehende Licht wird durch die Objektivlinse in die Zwischenbildebene fokussiert. Das so entstehende Bild wird durch die Okularlinse betrachtet. Nicht nur Licht aus der Brennebene des Objektivs (hier rot dargestellt) sondern auch unfokussiertes Licht aus Bereichen außerhalb der Brennebene (hier blau und grün dargestellt) erreicht bei diesem Mikroskop das Auge. Durch die Überlagerung von fokussiertem und unfokussiertem Licht ist die räumliche Auflösung des konventionellen Mikroskops eingeschränkt.

Beim konfokalen Mikroskop wird Licht, das nicht aus der Brennebene des Objektivs kommt, ausgeblendet. Die einfachste Konstruktion ist hier gezeigt: Die Kondensorlinse wird durch eine Linse ersetzt, die der Objektivlinse identisch ist. Die Ausleuchtung des Objekts wird durch eine Lochblende (A) beschränkt, die auf dem Objekt scharf abgebildet wird. Eine zweite Lochblende (C) beschränkt das Sichtfeld auf einen Punkt. Durch den symmetrischen Aufbau dieses Systems sind beide Blenden und ein Punkt des Objekts in der Brennebene der Linsen konfokal. Der Durchmesser der Blenden wird so klein gewählt, daß Licht aus Bereichen des Objekts, die nicht in der Brennebene liegen, nicht in die Apertur der Blende C fallen und damit ausgeblendet werden (hier: grüne und blaue Strahlen). In den Photomultiplier (PMT) gelangt deshalb nur Licht aus der Brennebene des Objekts.
Im Unterschied zum konventionellen Mikroskop erzeugt das konfokale Mikroskop also zunächst nur einen Bildpunkt, der allerdings genau einen Punkt aus der Brennebene des Objektivs darstellt. Um eine vollständiges Bild des Objekts zu erhalten, muß das Objekt Punkt für Punkt gerastert (gescannt) werden. Bei der hier gezeigten Anordnung geschieht das dadurch, daß das Objekt jeweils eine kleine Strecke verschoben wird, bevor der nächste Punkt vom Photomultiplier registriert wird ("stage scanning"). Die dabei gesammelten Bildpunkte werden dann von einem Rechner zu einem vollständigen Bild zusammengesetzt. Der Bildaufbau kann aber auch optisch (ohne Rechner) mit hilfe einer Nipkow-Scheibe erreicht werden. Bei den meisten modernen Konfokalmikroskopen wird nicht das Objekt bewegt, sondern ein Laserstrahl wird Punkt für Punkt über das Objekt geführt, und das Bild entsteht durch digitale Verarbeitung im Rechner: Laserscanning Konfokalmikroskop.
Nach: Minsky, M. (1988)

Am Beispiel einer Fluoreszenzdoppelfärbung ist hier der Vorteil der konfokalen Mikroskopie gezeigt. Bei dieser Zelle, die sich in der Meta-/Anaphase der Zellteilung befindet, ist die Plasmamembran mit einem rotfluoreszierenden Antikörper markiert, der Spindelapparat mit einem grünfluoreszierenden. Links das Bild mit dem konventionellen Mikroskop: Am Rand der Zelle sieht man Membranfärbung, die wie ein Schleier das ganze Bild überlagert. Die Darstellung der Spindelfasern ist unscharf, aber besonder intensiv in der Kinetochor-Region. Rechts: Die selbe Zelle in konfokaler Optik. Die seitliche Plasmamembran ist scharf dargestellt ("optischer Schnitt" durch Ausblenden unfokussierten Lichtes) und die Fasern des Spindelapparates sind zu erkennen.
Quelle: Imaging Technology Group

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