# Moderne Methoden der Zellbiologie

XII: Vom Protein zum Gen III (INHALT) |

### DNA-Sequenzierung | Genisolierung

Die Entscheidung, welcher Vektor (Bakteriophage oder Plasmid) für die Herstellung einer Bibliothek verwendet wird, hängt v.a. von der Anzahl der später zu untersuchenden Rekombinanten ab. Plasmide werden in Bakterienkolonien vermehrt. Der durchschnittliche Kolonie-Durchmesser beträgt ~1 mm. Bakteriophagen-Plaques haben einen durchschnittlichen Durchmesser von ~0,3 mm. Auf einer Agarschale von 15 cm Durchmesser können somit ca. 5.600 Kolonien aber auch 62.500 Bakteriophagen-Plaques angezüchtet werden. Soll eine Gesamtzahl von 106 Klonen durchmustert werden, so müßten 178 Platten mit Bakterienkolonien herstellt werden. Die gleiche Anzahl Bakteriophagen-Plaques ist auf 16 Platten unterzubringen. Diese Zahlen verdeutlichen, daß v.a. aus praktischen Überlegungen die meisten Gen-Bibliotheken in Bakteriophagen kloniert werden.
Zur Bestimmung der Gensequenz wird die Kettenabbruch-Methode nach Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467) verwendet. Ein Oligonukleotid, das mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert ist, bindet an einer definierten Stelle in der Plasmid-DNA. Eine DNA-Polymerase verwendet dieses Oligonukleotid als Startsignal für die Neusynthese des DNA Strangs. Die DNA-Synthese wird durch Reaktionsgemische, die entweder (ddA, ddG, ddC oder ddT) Didesoxynukleotide enthalten, nach unterschiedlichen Syntheselängen abgebrochen. Die Fragmente werden anschließend in denaturierenden Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt. Die Anregung mit Lasern ermöglicht in der Sequenzierapparatur schließlich die Detektion der Fragmente. Die Daten werden im Computer gespeichert und sind für die Auswertung und Zuordnung der Signale direkt verfügbar.

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Institut für Biologische Informationsverarbeitung im Forschungszentrum Jülich