# Moderne Methoden der Zellbiologie

IV: Fluoreszenztechniken II (INHALT) |

### Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration mit fura-2 | Ca2+-Imaging

Struktur von fura-2: Das fura-2 Molekül bindet Ca2+ mit vier Carboxylgruppen (ganz oben): fura-2 ist ein Ca2+-Chelator. Die Stilbengruppe (unten) ist der Chromophor des Moleküls. Dies Substanz ist sehr selektiv für Ca2+, und fast unempfindlich für pH-Schwankungen im physiologischen Bereich. Die Ca2+- Affinität ist sehr günstig für physiologische Messungen: Die Dissoziationskonstante ist etwa 0.25 µM, also genau in dem Bereich zellulärer Ca2+-Signale (0.1-1 µM). Aus: Grynkiewiz et al., (1985) Fluoreszenzemission von fura-2: Hier ist die Fluoreszenzintensität von fura-2 bei Anregung mit ultraviolettem Licht dargestellt. Die Fluoreszenz ändert sich sowohl mit der Wellenlänge des Anregungslichts als auch mit der Ca2+-Konzentration. In Ca2+-freier Lösung wird das blaue Spektrum mit einem Maximum bei 365 nm gemessen. Bei hoher Ca2+-Konzentration verschiebt sich sich das Maximum auf 340 nm, und das rote Spektrum wird gemessen. Nur bei 360 nm, dem isosbestischen Punkt, ist die Fluoreszenz unabhängig von der Ca2+-Konzentration. Bei Zugabe von Ca2+ zu einer fura-2-Lösung ergeben sich also zwei gegenläufige Änderungen der Fluoreszenzintensität (grüne Pfeile): Eine Zunahme bei 340 nm und eine Abnahme bei 380 nm. Auf diesem Effekt beruht die Verwendung von fura-2 zur Messung der Ca2+-Konzentration (siehe unten) Aus: Haugland (1992) |

Die besondere Eignung von fura-2 für Ca2+-Messungen kann man verstehen, wenn man überlegt, wie die Fluoreszenzintensität und die Ca2+-Konzentration zusammenhängen. Wenn eine fura-2-gefüllte Zelle mit Anregungslicht der Wellenlänge 340 nm beleuchtet wird, fluoresziert der Farbstoff bei ca 510 nm mit der Intensität F340. Die Intensität des Fluoreszenzlichtes wird bestimmmt durch die Konzentration des Farbstoffs (c), die Dicke der Zelle (d), eine Konstante (K), die die optischen Eigenschaften der Messapparatur zusammenfasst, und sie ist natürlich auch eine Funktion der Ca2+-Konzentration f[Ca2+]): |

Da aber weder c noch d noch K bekannt sind, ist es nicht möglich die Ca2+-Konzentration aus der Intensität des Fluoreszenzlichtes F340 zu berechnen. Hier hilft nun die Eigenschaft von fura-2, auf Anstieg der Ca2+-Konzentration mit einem Anstieg von F340 und meinem Abfall von F380 zu reagieren:

Führt man zwei Fluoreszenzmessungen kurz hintereinander durch, und zwar zuerst mit einem Anregunglicht von 340 nm und dann bei 380 nm, kann man annehmen, dass sich weder c noch d oder K zwischen den beiden Messungen ändern. Wenn man dann die beiden gemessenen Fluoreszenzintensitäten F340 und F380 durcheinender teilt, kann man die drei unbekannten Größen kürzen (rechts). Durch diesen Trick erhält man eine experimentell bestimmbare Messgröße (den Quotienten F340/F380), die NUR von der Ca2+-Konzentration abhängt. |

Der Quotient F340/F380 wird oft mit R (englisch: ratio) bezeichnet. Er ermöglicht die Messung absoluter Ca2+-Konzentrationen in lebenden Zellen, weil er unabhängig von Farbstoffkonzentration und Zellform ist. Um von einem gemessenen R-Wert auf die Ca2+-Konzentrationen schließen zu können, muß man die Ca2+-Abhängigkeit von R experimentell ermitteln. Man misst R bei einer Reihe von bekannten Ca2+-Konzentrationen und erhält eine Eichkurve, wie rechts dargestellt. Mit Hilfe dieser Kurve kann man für jeden in der Zelle gemessenen R-Wert die entsprechende Ca2+-Konzentration ableiten. |

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Institut für Biologische Informationsverarbeitung im Forschungszentrum Jülich